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文题释义：

0引言Introduction

1 材料和方法Materials and methods

1.1 设计

1.2 时间及地点

1.3 材料

    1.3.1 实验动物

    1.3.2 实验试剂和仪器

1.4 实验方法

    1.4.1 脂肪间充质干细胞的原代培养

    1.4.2 脂肪间充质干细胞的传代培养

    1.4.3 倒置显微镜观察细胞形态

    1.4.4 流式细胞仪检测目的细胞表面标志物CD分子的表达

    1.4.5 诱导成脂分化实验

    1.4.6 诱导成骨分化实验

1.5 主要观察指标

2 结果Results

2.1 原代细胞形态

2.2 第3-8代细胞形态

2.3 流式细胞仪检测细胞表面标记物的表达

2.4 脂肪间充质干细胞多向分化潜能

    2.4.1 成脂诱导分化潜能

    2.4.2 成骨诱导分化潜能

3 讨论Discussion

文章摘要:背景:脂肪间充质干细胞具有调控内分泌代谢、维持脂肪细胞周围微环境稳态、参与脂肪细胞发育等功能,在脂质代谢和肥胖症发生发展中起着重要作用。目前脂肪间充质干细胞的体外培养主要采用Ⅰ型胶原酶消化法,但其存在消化时间较长、效率低的缺点,故如何选择合适消化酶,以缩短消化时间、提高实验效率,值得关注和探索。目的:建立简单、高效的体外大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法,为临床开展干细胞治疗和基因治疗提供重要的细胞载体。方法:无菌条件下取出大鼠双侧腹股沟和附睾处的脂肪垫组织,用虹膜剪剪碎成糊状,加入2 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶消化45 min,洗涤离心后接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖型DMEM完全培养基中,置于CO₂培养箱内进行原代培养。待细胞达80%-90%融合时,以1∶3的比例进行传代培养。倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并对第4代目的细胞进行细胞表面标志物特异CD分子检测及成脂、成骨诱导分化实验。结果与结论:（1）原代培养3 d后,少量短梭形细胞爬出;5 d后,细胞呈集落或团簇样生长,形态为长梭形;6-8 d时,细胞集落相互融合,密度达80%-90%,呈漩涡状排列;传至第3代时,细胞增殖迅速,接种48 h后即可再次传代,且细胞形态均一,呈现明显的鱼群样生长;（2）流式细胞仪检测结果显示CD90、CD73和CD29表达阳性,CD34、CD45和CD11b/c呈阴性表达;（3）第4代脂肪间充质干细胞成脂诱导7-10d后,细胞形态逐渐由长梭形变为多边形或圆形,胞浆内积聚了大小不等的脂肪滴,经油红O染色后脂肪滴呈鲜艳深红色;而成骨诱导21 d后,细胞逐渐由长梭形变为多边形,呈聚集样生长,表面有大小不等的黑色小颗粒,局部有矿化样的结晶物;经茜素红染色后可见散在分布、大小不等的"蘑菇样"深红色球形结节;（4）由结果可见,该实验成功建立了一种简单、高效的大鼠脂肪间充质干细胞原代培养方法。

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